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RT-PCR試劑盒的兩種檢測(cè)模式介紹
點(diǎn)擊次數(shù):607 更新時(shí)間:2022-12-01
  RT-PCR試劑盒具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速等特點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥、真菌殘留檢測(cè),該方法從加樣、洗板、顯色到讀數(shù)步驟繁多,其中任何一步控制不好都可能影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
 
  今天要為大家介紹的是RT-PCR試劑盒的兩種檢測(cè)模式:
 
  1、雙雜交探針模式(FRET):FRET探針又稱雙雜交探針,F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成,在一條探針端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),另一探針端標(biāo)記Red640熒光基團(tuán)。當(dāng)復(fù)性時(shí),探針結(jié)合在模板上,F(xiàn)AM基團(tuán)和Red640基團(tuán)相鄰,激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光,作為Red640基團(tuán)的激發(fā)光被吸收,使Red640發(fā)出波長(zhǎng)為640的熒光。當(dāng)變性時(shí),探針游離,兩基團(tuán)距離遠(yuǎn),不能產(chǎn)生640波長(zhǎng)的熒光。由于FRET探針是靠近發(fā)光,所以檢測(cè)信號(hào)是實(shí)時(shí)信號(hào),非累積信號(hào)。
 
  2、交探針模式(Beacon):分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)寡核苷酸探針,兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì),因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅,由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見(jiàn)光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中,環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng),并與目標(biāo)序列互補(bǔ);莖一般5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng),并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端,而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下,因?yàn)槟0宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開(kāi),如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對(duì)。與模板配對(duì)后,分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀,使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí),因淬滅作用被解除,發(fā)出激發(fā)光子。由于是酶切作用的存在,分子信標(biāo)也是積累熒光。
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